馬布特羅快速檢測試劑盒使用說明書

【產品簡介】

馬布特羅屬于β-興類藥物，可提高胴體瘦肉率，曾被廣泛添加于飼料中。人食用了含馬布特羅殘留的動物性食品，會出現肌肉震顫、心悸、過敏、頭痛目眩、惡xn、嘔吐、發燒、顫栗等癥狀，世界各國已明文禁止其使用。常規儀器檢測方法不能滿足實際生產中大批量檢測的需求。馬布特羅快速檢測試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點，適用于大批量樣品快速檢測。

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA法檢測尿樣和組織等樣本中的馬布特羅，在微孔條上預包被偶聯抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的原理來進行，樣本中的馬布特羅和微孔條上預包被偶聯抗原競爭標記有辣根過氧化酶的抗馬布特羅抗體，通過洗滌后，用TMB底物顯色，樣品中的馬布特羅含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出馬布特羅含量。

【試劑盒技術指標】   

規      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.5ppb

檢測時間： 45min

尿      液………………………………… 1.5ppb

組      織（處理一）…………………… 1.5ppb

組      織（處理二）…………………… 0.5ppb

飼      料  …………………………………5ppb

交叉反應率：

馬布特羅（Salbutamol ）………………  100%

萊克多巴胺（Ractopamine）…………… <0.1%

樣本回收率：

尿     樣   ……………………… 85%±10%

組     織   ……………………… 85%±15%

飼     料   ……………………… 85%±15%

【試劑盒組成】

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

3、 高濃度標準品：×1瓶：（1ml/瓶） 1ppm

4、 酶標記物      7ml……………………… 紅色帽

5、 抗體工作液  7ml……………………… 綠色帽

6、 底物A液     7ml  ……………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

8、 終  止  液     7ml  ……………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml  ………………白色帽

【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：微孔酶標儀、氮氣吹干裝置、打印機、均質器 、振蕩器、離心機、恒溫箱、天平（感量0.0g）、刻度移液管

微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl

試          劑： 乙腈、甲醇、正己烷

【實驗前溶液配制】

配液1、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照

              1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按

             所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】

樣本處理前須知處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（c）實驗前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

（a）尿樣本的處理方法

           取50µl清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不用的樣本應冷凍保存

樣本稀釋倍數：1

由于尿液陰性樣本可能會產生背景干擾 （在某些情況下干擾數值在標準2到3之間），所以推薦標準3即1.5ppb作為尿液陽性結果的CUT OFF判斷值。

（b）組織樣本的處理方法一

1、  稱2±0.05g組織，加入6ml去離子水，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min。(注：若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。

2、  取50µl上清液進行分析。

 樣本稀釋倍數：4

（c） 組織樣本（肌肉和肝臟）處理方法二

1、 稱取均勻后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml乙腈溶液，充分振蕩2min。4000r/min以上，15℃離心10min；

2、 取上清液4ml，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至完quan干燥；

        肉樣本：

加入1ml 去離子水混合振蕩30s，取50µl用于分析。

肉樣本稀釋倍數：1

   肝臟樣本：

加入2ml正己烷振蕩溶解，再加入1ml 去離子水混合振蕩30s，4000r/min以上，15℃離心5min，去除上層；取50µl下層 與50µl去離子水混勻；取50µl用于分析。

肝樣本稀釋倍數：2

操作步驟：

1、 將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷凍。

3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃環境中反應30min。

5、 小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌液250µl/孔充分洗滌4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻25℃環境避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處 （建議用雙波長450/630nm，檢測在5min內讀完數據）測定每孔OD值。

【結果判定】

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含馬布特羅量成負相關。

 1、定性判定：

   用樣品的平均吸光度值與標準值比較即可得出樣本所含馬布特羅濃度范圍（ng/ml）。假設樣品1的吸光度值為0.333，樣品2的吸光度值為1.032，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.792；0.5ppb為1.501；1.5ppb為1.175； 4.5ppb為0.751； 13.5ppb為0.421；40.5ppb為0.198。則樣品1的濃度范圍是13.5ppb-40.5ppb；樣品2的濃度范圍是1.5ppb-4.5ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中馬布特羅實際濃度。

2、定量判定：

    所獲得每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以馬布特羅標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中馬布特羅實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

0.5                 1.5                   4.5                13.5             40.5

馬布特羅(ppb) [µg/kg]

                   圖1：馬布特羅檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現性：

        %CV

                 0           0.5           1.5            4.5          13.5          40.5

馬布特羅(ppb) [µg/kg]

圖2：馬布特羅檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出馬布特羅檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應馬布特羅濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。