青霉素快速檢測試劑盒使用說明書

一、檢測原理

      本試劑盒是利用競爭ELISA方法，在酶標板微孔上預包被抗青霉素抗原。檢測時，加入標準品或樣品溶液，青霉素受體和抗體以及酶標記物，包被抗原和加入樣本中的青霉素藥物競爭性地與青霉素受體抗體結合后，再與酶標記物形成抗原抗體復合物，用TMB底物顯色；加入反應終止液，在450nm波長酶標儀下進行檢測，樣品中的青霉素濃度與吸收光強度成反比。

二、檢測范圍

   本試劑盒是應用ELISA技術研發的藥物殘留檢測產品,與儀器分析技術比較，能經濟、快速地檢測出畜禽動物組織、蜂蜜、牛奶、飲用水中的青霉素殘留

三、試試劑盒技術指標

規      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間：75min

樣本檢測下限：

畜禽組 織（雞、鴨、豬肉等）……………0.1ppb

細胞培養液……………………………………6ppb

樣本回收率

畜禽組 織（雞、鴨、豬肉等）……………80% ±10%

細胞培養液……………………………………80% ±15%

反應率

青霉素………………………………………100%

四、試劑盒組成

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 酶標記物       7ml………………………紅色帽

4、 200×濃縮受體 50ul……………………離心管

5、 抗體工作液   7ml ………………………紅色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  …………………… 黑色帽

8、 終  止  液     7ml  …………………… 黃色帽

9、 20×濃縮洗滌液40 ml  ……………… 白色帽

10、 10× 濃縮復溶液  50ml ·………………   藍色帽

11、 蓋板膜……………………………………1張

12、 說明書 ……………………………………1份

【所用儀器、試劑】  

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、

振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl

（2）試劑（高檢測限處理方法時使用）：乙腈、正己烷、氯化鈉

【實驗前溶液配制】

配液1、1×復溶液：

 將10×濃縮復溶液用去離子水以1：9稀釋（1份10×濃縮復溶液+9份去離子水），用于樣本提取和稀釋。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

配液3 、受體工作液的配制：

取5ul的200X濃縮受體，加入1000ul配制好的1×復溶液混勻即可，或按所需用量配制抗體。

【樣本前處理步驟】  

樣本前處理須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（1）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

（2）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（3）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

（A）組織低檢測限快速處理方法（檢測限1.5ppb）

1、稱取1.0±0.05g均質過的組織樣本于10ml離心管中；加入4ml配好的1×復溶液進行提取，充分振蕩2min，4000r/min以上速度離心5min

2、取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數：5倍

（B） 組織高檢測限處理方法（檢測限0.1ppb）

1、 用均質器均質樣本；稱取3±0.05g樣本于50ml離心管中，加入1g氯化鈉，再加入6ml乙腈，用振蕩器振蕩5分鐘；4000轉/分以上,室溫離心10分鐘；

2、 取上清液2ml至干凈玻璃試管中，于65℃水浴下氮氣/空氣吹干；

3、 加入0.5 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml配好的1×復溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。

4、 取50 µl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數：0.5  

（c）細胞培養液

1、取1ml細胞培養液于離心管中，在3000r/min，4℃離心10min，去除上層脂肪。

2、取50µl上清液，加入950µl 稀釋后的復溶液混勻，混合30s

3、取50µl液體用于分析。

         樣本稀釋倍數：20倍

【酶聯免疫檢測步驟】

1、 從4℃冷藏環境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加配制好的受體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環境中反應30min。

5、 取出將孔內液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 加入抗體工作液50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環境中反應30min。

7、 取出將孔內液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色10min。

9、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定每孔OD值。

九、結果分析  

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含青霉素成負相關

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中青霉素實際濃度。

2、定量分析：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以氨芐青霉素啉標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氨芐青霉素啉實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準曲線

B/B0 (%)

青霉素(ppb) [µg/kg]

             圖1：青霉素檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現性

%CV

   青霉素(ppb) [µg/kg]

     圖2：青霉素檢測試劑盒的精密度

 由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出青霉素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應青霉素濃度作曲線，可以看到全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

十、注意事項

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。